Обнаружено в низкой концентрации

Исследование для выявления возбудителя гепатита B (HBV), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется наличие генетического материала (ДНК) вируса и его количество (вирусная нагрузка) в образце крови.

ДНК HBV может быть обнаружена в концентрации, находящейся за нижней границей линейного диапазона концентраций. Линейный диапазон концентраций – это диапазон, в котором можно точно посчитать количество копий возбудителя. Для данного анализа линейный диапазон концентраций ДНК HBV, определяемых тест-системой, составляет 75,0 — 1,0*10^8 МЕ/мл.

Синонимы русские

Вирус гепатита В (ВГВ), количественное определение ДНК.

Синонимы английские

Hepatitis B Virus DNA, Quantitative, Real-Time PCR, Blood; HBV Viral Load; Hepatitis B Virus DNA Quant.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Единицы измерения

МЕ/мл (международная единица на миллилитр).

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь.

Как правильно подготовиться к исследованию?

• Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Вирусный гепатит В (ВГВ) – инфекционное заболевание печени, вызванное ДНК-содержащим вирусом гепатита В (HBV). Среди всех причин развития острого гепатита и хронической вирусной инфекции вирус гепатита В считается одной из самых распространенных в мире. Действительное количество инфицированных неизвестно, так как у многих людей инфекция протекает без специфических симптомов и за медицинской помощью они не обращаются. Нередко вирус обнаруживают при проведении профилактических лабораторных исследований. По приблизительным подсчетам, в мире около 350 миллионов человек поражено вирусом гепатита В и ежегодно от его последствий умирает 620 тысяч. В России количество носителей HBV превышает 5 миллионов человек.

Источник инфекции – больной ВГВ или бессимптомный вирусоноситель. HBV передается с кровью и другими биологическими жидкостями. Заразиться можно при незащищенном половом контакте, использовании нестерильных шприцев, переливании крови и пересадке донорских органов, ребенка может заразить мать во время или после родов (через трещины в сосках). В группу риска входят: медицинские работники, у которых возможен контакт с кровью пациента, пациенты, получающие гемодиализ, инъекционные наркоманы, люди, ведущие беспорядочную половую жизнь, дети, рождённые от матерей с ВГВ.

Инкубационный период заболевания – от 4 недель до 6 месяцев. Вирусный гепатит В может протекать как в виде легких форм, длящихся несколько недель, так и в виде многолетней хронической инфекции. Основные признаки гепатита: желтушность кожных покровов, лихорадка, тошнота, утомляемость, в лабораторных анализах – нарушения функции печени и специфические антигены вируса гепатита В. Острое заболевание может быстро приводить к летальному исходу, переходить в хроническую инфекцию или заканчиваться полным выздоровлением. Считается, что после перенесенного ВГВ формируется стойкий иммунитет. Хронический вирусный гепатит В связан с развитием цирроза и рака печени.

Есть несколько специфических тестов для выявления существующего или перенесенного вирусного гепатита В. Для подтверждения наличия инфекции и уточнения периода заболевания используют определение антигенов вируса, антител к ним и ДНК вируса.

Полимеразная цепная реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. Методом ПЦР можно определить ДНК вируса качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается присутствие вируса гепатита В в организме и его активное размножение. Количественное определение вирусной нагрузки позволяет оценить интенсивность развития болезни, эффективность проводимой терапии или развитие устойчивости к противовирусным препаратам.

Существует зависимость между концентрацией вируса в крови и исходом острого вирусного гепатита В. При низком уровне виремии вероятность перехода инфекции в хроническую форму близка к нулю, а инфицированный человек неопасен для окружающих. При высокой вирусной нагрузке (5 копий/мл) хронизация возникает часто и больной является потенциальным источником инфекции. Доказана связь между количеством ДНК вируса в сыворотке крови, присутствием HBeAg, повышенной АЛТ и развитием цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (рака печени).

Эффективность противовирусной терапии оценивается по уменьшению количества ДНК вируса в крови. Через 3-6 месяцев после начала лечения вирусная нагрузка при адекватном терапевтическом ответе должна уменьшиться на 1-2 порядка. Отсутствие уменьшения количества вируса или его увеличение на фоне проводимого лечения требует пересмотра и изменения терапии.

Количественное определение ДНК вируса гепатита В совместно с клинической картиной заболевания и биохимическими показателями, маркерами инфекции, а также результатом пункционной биопсии печени позволяет дать прогноз заболевания и оценить необходимость противовирусной терапии.

Для чего используется исследование?

• Для прогнозирования течения вирусного гепатита В.
• Для подтверждения хронической формы вирусного гепатита В.
• Для выявления носителей вирусного гепатита В и мониторинга активности размножения вируса.
• Для выявления скрытых и мутантных штаммов вируса гепатита В.
• Для оценки эффективности противовирусной терапии гепатита В и принятия решения о дальнейшей тактике лечения.

Когда назначается исследование?

• При качественном обнаружении ДНК вируса гепатита В.
• При остром и хроническом вирусном гепатите В.
• При микст-гепатитах.
• До и во время противовирусной терапии.

Что означают результаты?

Референсные значения: не обнаружено

• «Не обнаружено» – ДНК вируса гепатита В не обнаружена или значение ниже предела чувствительности метода (50 МЕ/мл);
• от 75 до 1,2*10^5 МЕ/мл – ДНК вируса гепатита В обнаружена, низкая виремия;
• от 1,2*10^5 до 1,2*10^6 МЕ/мл – ДНК вируса гепатита В обнаружена, средняя виремия;
• более 1,2*10^6 МЕ/мл – ДНК вируса гепатита В обнаружена, высокая виремия;
• > 1*10^8 МЕ/мл – ДНК вируса гепатита В обнаружена в концентрации выше линейного диапазона концентраций.

Линейный диапазон концентраций ДНК вируса гепатита В, определяемых тест-системой, составляет 75,0 — 1,0*10^8 МЕ/мл.



Важные замечания

• Количественное определение ДНК вируса гепатита В является обязательным исследованием до назначения противовирусной терапии. Во время курса лечения анализ необходимо повторить через 3-6 месяцев.
• Вирусный гепатит В нередко сочетается с вирусным гепатитом D.

Также рекомендуется

• HBsAg
• anti-HBc, IgM
• anti-HBc, антитела
• anti-HBe, антитела
• anti-HBs, антитела
• HBеAg
• HBV, ДНК
• anti-HDV, антитела
• Anti-HCV, антитела, ИФА
• Гамма-глютамилтранспептидаза (гамма-ГТ)
• Аланинаминотрансфераза (АЛТ)
• Аспартатаминотрансфераза (АСТ)
• Фосфатаза щелочная общая
• Альбумин в сыворотке
• Билирубин общий
• Холестерол общий
• Тромбиновое время
• Фибриноген

Кто назначает исследование?

Инфекционист, гепатолог.

Литература

Каждый инструментальный метод характеризуется определенным уровнем шумов, связанным со спецификой измерительного процесса. Поэтому всегда существует предел содержаний, ниже которого вещество вообще не может быть надежно обнаружено.

Минимальная концентрация вещества, при которой сигнал аналита статистически значимо отличается от фонового, называется пределом обнаружения. Существует множество способов оценки предела обнаружения. Например, пределом обнаружения можно считать концентрацию, при которой сигнал вдвое превышает размах колебаний фона (рис).

Рис 4.6.1 Один из способов оценки предела обнаружения. При непрерывной регистрации сигнала видны как флуктуации фона, так и пик, обусловленный наличием аналита. Пик аналита можно считать надежно детектируемым, если его высота вдвое превосходит размах колебаний фона (в данном случае составляет 12 делений шкалы, считая от среднего уровня фона).

Общепринято считать пределом обнаружения такую концентрацию, при которой сигнал превышает фоновый на величину, равному утроенному стандартному отклонению фонового сигнала.

Пример. В ходе определения чистоты реактива спектрофотометрическим методом получили ряд значений оптической плотности фона (раствора сравнения). Эти величины составили 0,002; 0,000; 0,008; 0,006; 0,003. Стандартный раствор реактива с концентрацией 1 мкг/см3 имеет оптическую плотность 0,051. Чему равен предел обнаружения реактива.

Решение. Вычисляем стандартное отклонение фонового сигнала, что составляет 0,0032 единиц оптической плотности, а среднее значение фонового сигала 0,004 единицы. Предел обнаружения соответствует концентрации аналита, для которой сигнал превышает уровень фона на величину 3 · 0,0032 = 0,0096 единиц оптической плотности. Значение сигнала стандартного раствора за вычетом фона составляет 0,051 – 0,004 = 0,047.

Из пропорции 1 мкг/ см3 ——— 0,047

Х мкг/см3 ——— 0,0096

0,0096 + 0,004 = 0,014.

Погрешность определения концентрации на пределе обнаружения, в соответствии с определением этой величины, составляет

0,0032 · 100 / 0,0096 = 33 %.

Для надежных количественных измерений концентрация должна быть как минимум в 10 раз выше (2 мкг/мл) в приведенном примере.

Международный союз по теоретической и прикладной химии (IUPAC) рекомендует использовать для расчета предела обнаружения формулу

ПРобнар = 3 (Sпр / Sгр )

причем за величину Sпр принимать стандартное отклонение фонового сигнала;

Sгр. – стандартное отклонение углового коэффициента (m) градуировочного графика, вычисляют по формуле (Sm).

где Sy – стандартное отклонение величин y, вычисленное по формуле

(Более подробно см. в разделе 4.3) .

m — угловой коэффициент (тангенс угла наклона)

b – свободный член (из уравнения y=mx +b)

Контрольное задание № 6

Определить предел обнаружения железа в воде в соответствии с рекомендацией IUPAC.

Исходные данные: значения оптической плотности фона (раствора сравнения) составили 0,003; 0,001; 0,007; 0,005; 0,006. Значение Sгр рассчитать по данным, полученным при выполнении контрольного задания № 3 «Установление градуировочной характеристики для определения железа, с использованием метода наименьших квадратов».

5 П р и л о ж е н и я

Таблица 5.1 -Критические значения Q – критерия для различной доверительной вероятности Р числа измерений n:

Таблица 5.2 -Значения критерия Фишера (F – критерия) для уровня значимости α=0,05 (или доверительной вероятности Р=0,95)

f1 – число степеней свободы большей дисперсии, f2 – число степеней свободы меньшей дисперсии

Таблица 5.3 — Критические значения коэффициента Стьюдента (t – критерия) для различной доверительной вероятности Р и числа степеней свободы f:

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к способу снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений. Способ включает проведение в ходе движения реагентов вдоль иммунохроматографической тест-полоски конкурентного взаимодействия специфических антител с определяемым соединением (антигеном) в пробе и конъюгатом антиген-белок, иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны тест-полоски. Выявляют окрашенные комплексы в результате иммобилизации коллоидного маркера в составе комплекса с конъюгатом антиген-белок. При этом первая стадия представляет собой конкурентное взаимодействие свободных специфических антител с антигеном в пробе и с иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны конъюгатом антиген-белок. Вторая стадия представляет собой взаимодействие образовавшихся комплексов специфических антител и конъюгата антиген-белок с антивидовыми антителами, меченными коллоидным маркером. Предложенное изобретение позволяет уменьшить количество специфических антител на стадии конкурентного взаимодействия и благодаря этому снизить предел обнаружения. 5 ил., 1 пр.

Описание изобретения

Иммунохроматографический анализ нашел широкое распространение в различных областях медицины (тест-системы на маркеры заболеваний), контроля качества пищевых и кормовых продуктов (тест-системы на микотоксины, антибиотики), в решении ряда социальных проблем (определение наркотических соединений). Данный подход используется для анализа антигенов различной природы. В зависимости от определяемого соединения осуществляются различные схемы проведения взаимодействия иммунореагентов (G.A — Posthuma-Trumpie, J. Korf, A. van Amerongen, Anal Bioanal Chem, 2009,393,2,569-582; R.C. Wong, H.Y. Tee, Lateral flow immunoassay, NY, Springer, 2009, p.1-19). Если анализируются низкомолекулярные соединения, к которым относится множество практически значимых веществ, таких как микотоксины, антибиотики, пестициды и др., следует исходить из моновалентной природы взаимодействия этих веществ с антителами. Поэтому в таких случаях используется конкурентная схема анализа, в которой свободный и иммобилизованный антигены конкурируют за центры связывания меченных маркером антител.

Рассмотрим типичный конкурентный иммунохроматографический тест (прототип) (R.C. Wong, H.Y. Tee, Lateral How immunoassay, NY, Springer, 2009, p.1-19). Тест-полоска представляет собой пластиковую подложку, на которой зафиксированы рабочая мембрана (обычно нитроцеллюлозная), мембрана для конъюгата коллоидного золота, адсорбирующая мембрана для образца и конечная впитывающая мембрана (Рис.1).

При изготовлении такой тест-полоски на поверхность рабочей мембраны наносятся тестовые и контрольные зоны с иммобилизованным конъюгатом антигена с белком и антивидовыми антителами соответственно. Отдельно готовится мембрана под конъюгат — на нее наносятся раствор конъюгата коллоидного золота со специфическими антителами, различные стабилизаторы и консерванты. Мембрана под образец пропитывается раствором детергентов различной природы для обеспечения более эффективного тока жидкости вдоль рабочей мембраны. Все необходимые для образования сигнала взаимодействия инициируется погружением мембраны под образец в раствор пробы.

Проба, поступая на тест-полоску, взаимодействует с мечеными антителами, после чего вместе с ними двигается по рабочей мембране, доходя до зоны с иммобилизованным конъюгатом антигена с белком. Если в образце определяемое соединение отсутствовало, меченые антитела связываются с иммобилизованным конъюгатом, давая в этой зоне окрашенную линию. В случае присутствия антигена в пробе центры связывания антител заняты, и антитела проходят дальше, не давая окраски в аналитической зоне. Таким образом, образование и интенсивность окрашенной полосы в аналитической зоне свидетельствуют о наличии и концентрации антигена в пробе.

Для большинства задач необходима реализация тест-системы с максимально низким пределом обнаружения. Данное требование реализуется посредством максимального снижения количества специфических антител. Однако при достижении этого параметра у конкурентного иммунохроматографического теста есть ограничения. Чем ниже концентрация специфических антител, тем меньшее количество антигена в пробе будет требоваться для предотвращения связывания с фазой, и, следовательно, будет ниже предел обнаружения. Однако, так как специфические антитела связаны с окрашенным маркером, то снижение их концентрации повлечет за собой снижение интенсивности сигнала. Таким образом, чем лучше предел обнаружения системы, тем ниже интенсивность сигнала и, как следствие, хуже воспроизводимость и достоверность результата. Помимо этого, при получении конъюгата специфических антител с коллоидным маркером на поверхности коллоида иммобилизуется значительное количество антител — до 100 и более (Л.А. Дыкман, В.А. Богатырев, С.Ю. Щеголев, Н.Г. Хлебцов. Золотые наночастицы. Синтез, свойства, биомедицинское применение. 2008, Москва, Наука). Высокая концентрация антител увеличивает порог для конкурентного вытеснения, тогда как для связывания с иммобилизованным коньюгатом антиген-белок достаточно одной молекулы антител. В то же время при работе со специально полученными конъюгатами коллоидного маркера с малым числом молекул антител маркер становится стерическим препятствием для взаимодействия иммобилизованного на коллоиде антитела с иммунореагентом на поверхности мембраны.

Нами было предложено разделить стадии конкурентного взаимодействия и введения окрашенной метки. Это позволяет значительно снизить количество антител на стадии специфического взаимодействия, что, в свою очередь, приводит к повышению чувствительности системы и обеспечению достаточной интенсивности окраски в отсутствие конкурента.

Рассмотрим предлагаемую процедуру анализа. Через рабочую мембрану последовательно пропускаются предварительно совместно проинкубированная смесь свободных специфических антител и пробы. В случае наличия антигена в пробе центры связывания специфических антител оказываются заняты антигеном и взаимодействия в аналитической зоне рабочей мембраны не происходит. В противном случае свободные центры связывания антител связываются с иммобилизованным конъюгатом антиген-белок в аналитической зоне. После отмывки буферным раствором через тест-полоску пропускается раствор антивидовых антител, меченных коллоидным золотом. В результате в аналитической зоне образуются специфические комплексы, которые дают окрашенную полосу.

Для реализации такого метода тест-полоска изготавливалась отличным от прототипа способом. В ее комплектацию не входили мембрана под образец и мембрана под конъюгат, а вместо них использовались растворы специфических антител и конъюгата коллоидного маркера с антивидовыми антителами.

Описанная выше схема анализа, в которой детектируемое визуально или приборно окрашивание обеспечивается за счет последовательного взаимодействия а) свободных специфических антител с антигеном в пробе и конъюгатом антиген-белок и б) образовавшихся комплексов специфических антител и конъюгата антиген-белок с антивидовыми антителами, меченными коллоидным маркером, представлена на Рис.2.

Данное методическое решение обладает существенными преимуществами по сравнению с известными разработками иммунохроматографических тестов, в которых также реализуется усиление сигнала.

Вторым аналогом является схема использования двух конъюгатов золота разного размера, описанная в работе (D.H. Choi, S.K. Lee, Y.K. Oh, B.W. Bae, S.D. Lee, S. Kirn, Y.B. Shin and M.-G. Kirn, Biosensors and Bioelectronics, 2010, 25, 8, 1999-2002). В данном случае используются две последовательно установленные мембраны под конъюгат, на первой из них иммобилизованы антитела против бычьего сывороточного альбумина, на второй — специфические антител против исследуемого антигена. Используются коллоиды разного размера, что позволяет, с одной стороны, разделить их в процессе движения по мембране, препятствуя смешиванию до достижения контрольной и аналитических зон, а с другой — усилить аналитический сигнал. Однако стабильность такой тест-системы невысока, т.к. как реагенты должны смываться с мембраны без задержки.

Эффективность предложенного в патенте подхода подтверждается представленным ниже примером.

Пример 1. Определение афлатоксина В1 иммунохроматографическим методом. В аналитический набор, помимо тест-полоски, входят три дополнительных реагента — промывочный раствор (фосфатный буфер с детергентом), конъюгат коллоидного золота с антивидовыми антителами (в концентрации 1 единица оптической плотности при 520 нм) и раствор специфических антител против афлатоксина В1 (2,5 нг на один тест при ширине тест-полоски 3,5 мм). Сама же тест-полоска лишена дополнительных мембран и представляет из себя расположенные на подложке рабочую мембрану с иммобилизованными реагентами аналитической и контрольной зоны (конъюгатом афлатоксина В1 с бычьим сывороточным альбумином и иммуноглобулинами мыши соответственно) и соприкасающуюся с ней впитывающую мембрану. Анализ выглядит следующим образом:

— Анализируемая проба смешивается с раствором специфических антител и инкубируется в течение 5 минут.За это время происходит взаимодействие антигена в пробе с центрами связывания антител.

— В полученную смесь опускается тест-полоска нижней частью рабочей мембраны на высоту около 2 мм. После инкубации в течение 5 минут фронт жидкости доходит до аналитической зоны, где антитела, в зависимости от наличия антигена в пробе, взаимодействуют с иммобилизованным конюгатом афлатоксин В1-бычий сывороточный альбумин.

— Опуская нижний край рабочей мембраны, тест-полоску помещают в промывочный раствор (фосфатно-солевой буфер с детергентом) на 5 минут для проведения промывки рабочей мембраны от несвязавшихся антител.

— Для визуализации результатов анализа через полоску пропускается раствор конъюгата коллоидного золота с антивидовыми антителами.

Для сравнения были изготовлены тест-полоски по традиционной методике. При этом использовались те же специфические антитела (в составе конъюгата с коллоидным золотом на один тест тратится 100 нг антител) и конъюгированный с бычьим сывороточным альбумином микотоксин. Для проведения анализа готовые тест-полоски погружали в раствор анализируемых проб с различной концентрацией афлатоксина В1 и инкубировали в течение 10 минут.

Для количественной оценки связывания маркера в обоих случаях тест-полоски сканировали на сканере Lide 90 (Canon) с разрешением 600 dpi, без автоматического контрастирования и цветокоррекции. На полученных цифровых изображениях выделяли прямоугольную область, захватывающую не менее чем 90% окрашенной зоны, и с помощью программы Total Lab (Nonlinear Dynamics, Великобритания) получали численное значение интенсивности окрашивания аналитической зоны.

Условия проведения анализа были подобраны так, чтобы амплитуды сигнала для обеих схеем были близки, обеспечивая одинаковую степень достоверности визуальной регистрации результатов анализа и одинаковую точность приборной регистрации.

Изображения тест-полосок после тестирования проб с разным содержанием афлатоксина В1 представлены на рис.3 (предлагаемая схема проведения анализа) и Рис.4 (традиционная схема), а результаты цифровой регистрации — на рис.5. Как видно из рисунков, предел обнаружения при использовании схемы без усиления составляет 1 нг/мл для визуального определения и 80 нг/мл при использовании приборной обработки данных, в то время как для предложенной схемы данные значения составляют 0,1 нг/мл и 20 пг/мл соответственно. Выигрыш в величине предела обнаружения — 10 раз для визуальной и 4 раза для приборной детекции.

На рис.1 представлена схема организации тест-полоски для проведения конкурентного иммунохроматографического анализа (А.Е. Урусов, С.Н. Костенко, П.Г. Свешников, А.В. Жердев, Б.Б. Дзантиев. Журнал аналитической химии. 2011, Том 66, №8, С.884-890). 1 — пластиковая основа, 2 — мембрана адсорбирующая образец, 3 — подложка под конъюгат, 4 — рабочая мембрана, 5 — аналитическая зона, 6 — контрольная зона, 7 — конечная адсорбирующая мембрана, 8 — специфические антитела, 9 — частицы коллоидного золота, 10 — белок-носитель, 11 — антиген, 12 — антивидовые антитела. На рис.2 представлена схема иммунохроматографического анализа с усилением аналитического сигнала конъюгатом коллоидное золото — антивидовые антитела. 1 — иммобилизация конъюгата микотоксин-БСА, 2 — конкурентное взаимодействие, 3 -усиление сигнала, 4 — БСА, 5 — микотоксин, 6 — специфические антитела, 7 — коллоидное золото, 8 — антивидовые антитела, 9 — рабочая мембрана, 10 — впитывающая мембрана. На рис.3 приведен внешний вид тест-полосок после проведения определения афлатоксина В1 с усилением коллоидным золотом. Стрелкой отмечена контрольная зона. На рис.4 приведен внешний вид тест-полоск после проведения определения афлатоксина В1 при использовании традиционной схемы анализа. Стрелкой отмечена контрольная зона. С — концетрация афлатоксина В1,1 — амплитуда сигнала. На рис.5 представлены калибровочные кривые определения афлатоксина В1 в предлагаемой и традиционной иммунохроматографических системах, полученные на основании экспериментальных данных рис.3 и 4, соответственно. 1 — предлагаемая система, 2 — традиционная система. С — концетрация афлатоксина В1, I — амплитуда сигнала.

Способ снижения предела обнаружения иммунохроматографических методов контроля содержания низкомолекулярных соединений, основанный на проведении в ходе движения реагентов вдоль иммунохроматографической тест-полоски конкурентного взаимодействия специфических антител с определяемым соединением (антигеном) в пробе и конъюгатом антиген-белок, иммобилизованным на поверхности рабочей мембраны тест-полоски, и выявления окрашенных комплексов в результате иммобилизации коллоидного маркера в составе комплекса с конъюгатом антиген-белок, отличающийся тем, что детектируемое визуально или приборно окрашивание обеспечивается за счет последовательного взаимодействия а) свободных специфических антител с антигеном в пробе и конъюгатом антиген-белок и б) образовавшихся комплексов специфических антител и конъюгата антиген-белок с антивидовыми антителами, меченными коллоидным маркером.